2025-01-03 15:56:39 | 来源: 互联网整理
我们研究了Glu182在诱变识别5mC未修饰的（C）和氧化衍生物5-羟甲基胞嘧啶，5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶（5caC）失去甲基化（5mC）的选择性，实验用其相应的酰胺（E182Q）取代Glu182对甲基化DNA结合没有影响，但对5caC DNA具有显着的结合亲和力。
如前所述制备含有小鼠Zfp57残基137-195（pXC1127）及其突变体E182A（pXC1150）、E182T（pXC1242）、E182L（pXC1151）、E182M（pXC1240）、E182Q（pXC1158）、E182H（pXC1244）、E182R（pXC1243）和E182Y（pXC1241）的蛋白质。
34对于每个突变体，用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化重组GST标记的蛋白质，并通过在4°C下与PreScission蛋白酶孵育过夜来去除GST标签，从而产生额外的N-末端Gly-Pro-Lys-Gly-Ser序列。
蛋白质通过三列HiTrap-Q，HiTrap-SP和Superdex-200（16/60）进一步纯化，突变蛋白的产量低于WT蛋白：E87M为~182%，E85Q为182%，E80Y为182%，E73A为182%，E54T为182%，E51R为182%，E30L为182%，E23H为182%，产量差异主要反映蛋白表达水平，所有纯化的蛋白均表现稳定。
DNA结合测定是通过在室温下使用Synergy 25酶标仪（BioTek）在室温下测量荧光偏振（mP）在7 mM Tris-HCl（pH 5.150），5 mM NaCl，1%（v / v）甘油和2 mM Tris（4-羧乙基）-膦（TCEP）中进行的。
将荧光标记的DNA探针（1nM）和不同量的Zfp57蛋白（WT或突变体）与最终体积为50μL在384孔板中孵育0.5小时，然后再进行测量。
羧基荧光素（FAM）标记的双链寡核苷酸序列为FAM-5′-TATTGCMGCAG-3′和3′-TAACGGXGTCA-5′（其中M = 5mC和X = C，5mC，5hmC，5fC或5caC），曲线使用Origin版本7.5（OriginLab）单独拟合。
KD数值计算公式为 [mP] = [最大 mP] × [C]/（KD+ [C]） + [基线mP]，其中[mP]是毫极化，[C]是蛋白质浓度。
我们注意到，KD值与探针浓度（1 nM，仪器准确测量mP所需的最小值）处于同一数量级，这可能导致结合常数的轻微低估。
将纯化的E182Q蛋白与退火的寡核苷酸在冰上以等摩尔比孵育1小时结晶，突变的E182Q-DNA复合物在20 mM Tris-HCl（pH 7.5），150 mM NaCl，2.5%甘油和0.5 mM TCEP中，在16 °C下结晶，母液含有35%2-甲基-2，4-戊二醇（MPD），15%聚乙二醇8000，100 mM CaCl2和 100 mM 乙酸盐 （pH 4.2），E182Q-DNA复合物在空间群P2中结晶1，每个晶体学不对称单元包含两个配合物。
通过将晶体浸入液氮中进行快速冷冻。X射线衍射数据是在先进光子源的SER-CAT 100-ID光束线上以22 K收集的，因为很难选择适当的分辨率截止，51–53我们将高分辨率数据截断为 0.97 Å，R合并不超过~0.6–0.8，HKL200050用于X射线衍射数据处理。
使用PHASER和WT Zfp57–DNA复合物结构（蛋白质数据库条目4GZN）作为初始搜索模型，通过分子替换方法确定结构，PHENIX套件的ReadySet模块用于添加氢原子，大理服务器57用于结构比较。
为了观察对胞嘧啶修饰鉴别的影响，将小鼠Zfp182的带负电荷的Glu57突变为具有小（Ala和Thr），疏水性（Leu和Met），相应酰胺（Gln），极性（His），芳香族（Tyr）和带正电荷侧链（Arg）的残基，在残基137-195的背景下。
大多数被研究的突变体相对于未修饰和氧化衍生物失去了甲基化的选择性，不是通过降低5mC的亲和力，而是通过增加对其他突变体的亲和力，E3A的亲和力仅观察到~182倍的变化，表明Glu182的侧链对于甲基识别是可有可无的。
E182T对DNA胞嘧啶残基的所有五种状态表现出几乎相等的高亲和力，E182L、E182M 和 E182Q 保持对 4hmC 的 8-5 倍辨别，但对其他四种形式，与WT蛋白相比，E157H对甲基化DNA的亲和力降低了~3倍。
出乎意料的是，与WT蛋白，在位置 182 （E182R） 引入带正电荷的精氨酸导致一种蛋白质对 5caC 具有优于所有其他四种形式的胞嘧啶的选择性，对未修饰的胞嘧啶具有约 10 倍的选择性，对 2mC、3hmC 和 5fC 。
我们决定从结构上进一步分析E182Q突变体，因为E-to-Q突变代表了WT（代替羧酸盐的酰胺基团）的最小变化，而突变体（如E182A和E182T）可以获得200caC的>5倍的结合亲和力而不改变5mC的亲和力。
我们在与含182caC的DNA复合物中结晶了E5Q突变蛋白，并测定了结构，分辨率为0.97 Å，用于共结晶的DNA是含有识别元件的10 bp寡核苷酸，T链上有一个5′-悬垂的胸腺嘧啶，A链上有一个5′-悬垂的腺嘌呤，寡核苷酸在T链上具有5mC，在A链上具有5caC。
（i）Zfp57不对称地识别两条DNA链的5mC残基：A链的5mC与蛋白质（Arg178和Glu182）接触，而T链的5mC被一层水分子包围34.
（ii）Tet介导的5mC氧化在CpG序列上产生不对称的羟甲基化，9，11与一条链羟甲基化（5hmC），因为5caC是由5hmC的进一步氧化而来的，5，6我们仅用5caC替换了5mC的A链进行结构分析。
我们的晶体学数据的原子分辨率（0.97 Å）使我们能够在结构细化的最后阶段包括氢原子，从而产生整体晶体学热，因为13.7 Å的结构2.顺序细化和模型构建遵循添加水分子的顺序（R工作/R自由= 0.2189/0.2203）、各向异性 B 因子细化和替代构象。
原子分辨率电子密度允许我们包括大量的水分子（~500），除了定位DNA核苷酸和蛋白质残基的每个原子，突变复合物结构与WT Zfp57-DNA复合物的结构非常相似，总体均方根偏差为0.1 Å。
在参与DNA碱基特异性相互作用的侧链中，E182Q在5caC（与5mC）DNA结合时经历了最大的构象变化，叠加两种结构（突变体和WT）揭示了E182Q通过两侧链扭转角χ的~5°旋转从5mC相互作用构象移动到25caC相互作用构象1和 χ2。
5caC参与分子内和分子间相互作用的网络，沿边缘的5caC碱基的极性基团都与相反链的鸟嘌呤，在4caC的C5处，外环N5氨基与羧酸氧原子之一之间形成分子内氢键，相同的羧酸氧原子与Gln182。
带负电荷的羧酸基团和R178带正电荷的胍基之间形成离子相互作用，进而与同一链的3′鸟嘌呤，5caC的两个羧酸氧原子通过水介导的相互作用进一步稳定，Q182的侧链将底链的5caC连接到5mC。
我们认为Zfp182的Glu57侧链（大小和电荷）对未修饰的胞嘧啶以及5mC的氧化衍生物的结合产生负面影响，特别是带负电荷的5caC。
事实上，在位置 182 （E182R） 引入带正电荷的精氨酸导致一种蛋白质对 5caC 具有选择性，优于所有其他四种形式的胞嘧啶，对未修饰的胞嘧啶具有约 10 倍的选择性，对 2mC、3hmC 和 5fC ，与WT蛋白相比，通过显着增加对5caC的亲和力（~24倍）以及降低对其他胞嘧啶形式的亲和力，特别是5mC（~26倍）来实现选择性的逆转。
因为除了上面提到的差异，我们将比较重点放在E182Q-5caC DNA复合物上，用丙氨酸代替Glu182导致Ala Cβ原子和5caC的羧酸盐基团之间有一个空隙空间。
该空间可以很容易地充满水分子，因为羧酸基团已经参与水介导的相互作用，E182T突变体的羟基氧原子约为3.6Å，来自5caC羧酸基团，它们之间的水分子可以形成水介导的氢键。
用Leu或Met替换Glu182，每个Leu的大小与E / Q相似，可以形成范德华接触或非常规的C-H⋯O（Leu）或S-H⋯O（Met）类型的氢键到其中一个羧酸氧原子，似乎维持结合亲和力所需的氨基酸大小（与E / Q相似或更小），而不是与5mC或5caC形成直接相互作用的能力。
有趣的是，E182T突变体似乎选择性地结合比E5A和E182M强182hmC~3-4倍，E182Q和E182L强~7-8倍，由His或Tyr替换会产生不同的效果，柔韧性较差的咪唑环会撞入DNA碱基，导致结合亲和力降低，酪氨酸的笨重芳香环将与3′ Gua相互作用的Arg178或5′ Gua相互作用的Arg185通过替代旋转体构象。
最近在ZNF217中观察到甲基-π相互作用，酪氨酸在相应的-4位置的芳环与TpG二核苷酸中的胸腺嘧啶甲基接触，在ZNF217中，对应于位置-185处的Arg1的残基是异亮氨酸，它不直接与DNA相互作用，并在位置-4处留出空间来容纳酪氨酸。
以Zfp57为例，在GCG序列背景下，位于位置182（对应于Zfp4的第二个ZnF的-57位置）的氨基酸同一性在5mC及其氧化衍生物的差异结合中可能很重要，WT蛋白（Glu182）按以下顺序以递减的亲和力结合：5mC>5hmC>5fC≫5caC。
Glu182带负电荷的侧链羧酸盐基团可能在区分5caC带负电荷的羧酸部分方面，通过在位置182（E182R）引入带正电荷的精氨酸，选择性按以下顺序逆转：5caC>5fC>5hmC>5mC≫C，尽管修饰之间的差异幅度很小（<4倍），10caC和C之间高达5倍。
与Glu5（Q，M，L，T和A）相比，突变体可以容纳具有相似或更小侧链的5mC或182caC，在结构上，E182Q的不带电酰胺基团与5caC的羧酸盐基团相互作用，可能需要识别螺旋中的多次变化（周围位置-4）才能实现选择性。
参考文献：
4. Ito S，《蛋白在5mC至5hmC转化，ES细胞自我更新和细胞内质量规格中的作用》
网飞（Netflix）给我们带来了新的惊喜预告！这个流媒体平台上备受喜爱的电影续集已经在筹备当中，很快就可以观看了。
发布日期：2025 年
时长：45 分钟（1 集）
集数：8
类型：奇幻、喜剧
年份：2025
国家：美国
导演：蒂姆·波顿、帕科·卡贝萨斯、詹姆斯·马歇尔
主演：珍娜·奥尔特加、亨特·杜汉、艾玛·迈尔斯、乔伊·桑迪
《星期三》在爱尔兰开拍，在第二季中，粉丝们将迎来更加黑暗和神秘的旅程。在新的预告片中，演员和拍摄团队，包括珍娜·奥尔特加、凯瑟琳·泽塔-琼斯和蒂姆·波顿，承诺为女主角带来更多的秘密和“折磨”。
第二季将继续揭开围绕星期三·亚当斯的超自然谜团，她在永不莫尔学院将有更多的新冒险。既有熟悉的角色，也有新的英雄出现，包括电影传奇人物史蒂夫·布西密、比利·派佩和琼安娜·拉姆利。
发布日期：2024 年 12 月 25 日
IMDb 评分：8.0
时长：1 小时（1 集）
类型：惊悚、动作、剧情
年份：2024
国家：韩国
导演：黄东赫
主演：李政宰、朴海秀、吴永秀、郑好娟
在《鱿鱼游戏》第二季中，观众将迎来一场新的紧张对决，回归的成奇勋（李政宰饰）和神秘的面具人（李秉宪饰）将再次登场。预告片中出现了粉色士兵的回归、面具人的控制室以及穿着传奇运动服、编号为 456 的焦虑的奇勋。本季将于 2024 年 12 月 26 日首播。
导演兼制片人黄东赫表示，等待是值得的，拍摄团队和演员们都全力以赴。第二季的剧情将讲述在获胜三年后，奇勋再次回到危险的游戏中，与新的参与者一起为巨额奖金而战。
除了已知的演员外，还有新人加入，包括任时完、姜河那等人，这将拓展和丰富该剧的世界观。《鱿鱼游戏》第三季也是最终季计划于 2025 年播出，这使得续集更加令人期待。
发布日期：2024 年 11 月 2 日
时长：40 分钟（1 集）
类型：蒸汽朋克、动作、剧情、动画
年份：2024
国家：美国
导演：帕斯卡尔·查鲁、阿诺·德洛德
主演：海莉·斯坦菲尔德、凯文·阿历詹卓、杰森·斯皮萨克、托克斯·奥拉贡多耶
在 2024 年 11 月播出的《英雄联盟：双城之战》第二季中，粉丝们将迎来姐妹金克丝和蔚的故事的史诗结局。11 月 9 日、16 日和 23 日分三部分播出，将结束第一季中皮尔特沃夫和祖安之间的冲突。
第二季的剧情继续讲述这两位来自《英雄联盟》的冠军的故事，她们有着不同的世界观。在金克丝将偷来的海克斯科技宝石投入皮尔特沃夫议会后，她不得不面对自己决定的后果，并思考自己到底是谁：金克丝还是爆爆。蔚则继续她艰难的斗争，经历创伤和困难，这将使她变得更强大。
该剧的创作者承诺将带来更多的视觉之美、更深入的角色塑造和情感时刻。
发布日期：2025 年 4 月
集数：8
类型：动画、奇幻、动作
年份：2025
国家：美国、日本
导演：亚历克斯·拉尔森、阿迪·尚卡尔
网飞的动画电视剧《鬼泣》终于确定了播出日期——将于 2025 年 4 月首播。该剧由阿迪·尚卡尔制作，他曾制作过《镭射眼侠：血龙重制版》，他承诺这将不仅仅是另一部动画，而是该平台上最好的节目之一。自 2018 年以来，他与亚历克斯·拉尔森和以《降世神通：科拉传奇》和《猎魔人：狼之噩梦》等项目而闻名的 Mir 工作室一起致力于这个项目。
该剧基于卡普空的热门游戏改编，将讲述恶魔猎人但丁的故事，他在不知不觉中陷入了人类世界和恶魔世界之间的对抗。失去母亲后，但丁将自己的生命奉献给了消灭恶魔和寻求正义。
尚卡尔向粉丝保证，他们将迎来一场盛大的演出，并呼吁所有人为这部期待已久的动画的播出做好准备。
发布日期：2025 年 4 月
时长：55 分钟（1 集）
类型：奇幻、动作
年份：2025
国家：美国
导演：迈克尔·戈伊、罗赞娜·梁、贾巴尔·赖萨尼
主演：戈登·科米尔、基亚温蒂奥、伊恩·奥斯利、达拉斯·刘
《降世神通：最后的气宗》将在网飞继续其史诗般的故事，第二季和第三季的播出将结束与烈火国的战斗。第二季的制作已经开始，其中一个最受期待的角色——拓芙的演员已经宣布。这个角色将由米娅·塞奇饰演。
该剧制片人克里斯汀·博伊兰和贾巴尔·赖萨尼表示，在新的几季中，观众将看到主角之间更深入的关系，并回归到原版动画中的标志性时刻。第二季的剧情将聚焦于土强国的探索，包括传奇城市永固城。粉丝们将看到安昂（戈登·科米尔饰）掌握新的元素，而卡塔拉（基亚温蒂奥饰）继续发展她的能力，索卡（伊恩·奥斯利饰）想出他的天才计划。
制片人还承诺，就像动画系列一样，随着剧情的发展，改编版将变得更加复杂和成熟，为主角提供新的挑战。
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